健康水貂肠道内益生乳酸菌的筛选、分离、鉴定及应用研究
摘要：通过对健康水貂全肠道内容物中附着不同微生物的提取，分离筛选出益生微生物，对其培养并做生长特性检测，通过不同温度生长实验、不同时间OD值测定、产酸性实验、抑菌性实验、菌株安全性检测来筛选目的菌株。进一步对目的菌株进行菌种鉴定，做镜检、革兰氏染色，过氧化氢酶实验，运动性实验，碳水化合物发酵产酸实验（23种糖），温度实验，16S rDNA序列分析。最后选择优良菌株作为日粮佐剂。
关键字： 水貂 肠道 益生菌 乳酸菌 分离 鉴定
Abstract: By extracting the attachment of different microorganisms in the intestines of healthy mink, Separating and screening out of which probiotics, Culture for them and do Growth Characteristics Test for screening the purpose bacteria as follow: Growth experiments at different temperatures, OD values measured at different time, Acid production experiments, Inhibition of bacteria experiment, Strains security checks. Further, for the purpose of species identification of bacteria as follow: Microscope detection, Gram Staining, Catalase test,motion test, Carbohydrate ferment acid test(23 kinds of sugar), Temperature Experiment, 16S rDNA Sequence Analysis. Final choice of diet adjuvant use the fine strains of bacteria.
Keywords： Mink, Intestinal ,Probiotics, lactobacillus,Separating, Screeing
1 益生微生物研究的兴起
在生物技术迅猛发展的今天, 一门研究正常微生物群的结构、功能及其与宿主相互依赖和相互制约关系的生命科学——微生态学（Microecology）正在兴起。随着微生态学理论研究的不断深入，微生态制剂（或称微生态调节剂）也随之迅速发展起来。微生态制剂中的活性成分主要为益生菌（Probiotics），也有译为“益生素”，“原生菌”等。它是从早在1907年梅契尼柯夫（Metchnikoff）提出的发酵乳制品有助于健康长寿的理论中发展而来的。[1]英文Probiotics一词源于希腊语，意思是“为了生命”（for live），与Antibiotics相对立。而它的现代定义则是最早在1965年被Lilley和Stillwell阐述为“有一种微生物分泌的刺激其它微生物生长的物质或组织提取物。”[2] 此后，随着益生菌研究的深入，益生菌定义也逐渐被完善，益生菌数量及其保健功效方面也都得到进一步丰实。[3] 现在一般认为：益生菌剂是含生理活性菌或死细胞(包含代谢产物与细胞组成)，[4] [5] 摄取后可改善粘膜表面菌群或酶的平衡，或刺激机体的特异性或非特异性免疫力的微生物制剂。[6]
自70 年代德国汉堡成立第一所微生态学研究所起，微生态学逐渐发展成为一门新兴学科而令人瞩目。[7] 微生态学是生命科学的分支，作为一门研究生物体正常微生物群与其宿主相互依赖、相互制约规律的科学，[8] 它涉及生物体与其内环境（包括微生物、生物化学和生物物理环境)相适应的问题，[9] 从最初的对双岐杆菌、乳杆菌、大肠杆菌等活菌的生态疗法到现在的多种微生态制剂的问世，[10] 无论从数量和规模以及市场效益方面来看，都有着诱人的前景。
2 微生态制剂的优越性
据世界卫生组织统计，中国是滥用抗生素最严重的国家之一，抗生素的滥用已造成一系列的问题，[11] 由于长期以来使用的抗生素种类比较多，引起的不良反应也会涉及动物体的每一个系统。 [12] 在服用抗生素的同时,也杀灭了胃肠道中的正常菌群,导致胃肠道内的微生态平衡失调,也会使细菌产生耐药性，[13] 细菌产生耐药性的速度远远快于我们新药开发的速度，引起菌群失调，二重感染以及动物细胞免疫、体液免疫功能下降,[14] 同时抗生素也随畜产品食物链进入人体，[15] 无残留的微生态制剂在养殖业生产中越来越普遍。
随着使用抗生素的弊端日益凸现，动物微生态学理论及基于该理论的微生态制剂得到空前发展。[16] 微生态制剂是由正常微生物菌群所制成的一类生物制剂，它可通过调节机体微生态平衡来促进动物胃肠道正常微生物区系的建立、增强畜禽免疫力、提高饲料利用效率、改善畜产品质量，有显著的经济效益和社会效益。[17][18] 微生态制剂具有无毒副作用、无耐药性、无残留、成本低、效果显著、不污染环境等功效。微生态饲料添加剂作为一种新型绿色饲料添加剂，与普通的饲料添加剂相比具有许多优点：[19][20] 1.这些有益微生物能产生蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶等，[21] 可以帮助消化吸收日粮中的营养物质，显著提高饲料利用率，节约生产成本。 [22][23] 2.适口性好。饲料在添加了微生态制剂后，经发酵产生多种不饱和脂肪酸和芳香酸，[24] 使饲料有一种特别的芳香味，可明显刺激家畜的食欲。 [25][26] 3.可预防或减少动物病害。由于微生态制剂含有多种有益细菌，它们在动物肠道中能抑制机体内有害细菌的生长繁殖，[27] 能防止动物的拉稀和腹泻，起到预防疫病的作用，从而降低动物的发病率和死亡率。[28] 4.由于微生态制剂不含任何抗生素、激素和药物等对人体有害物质，[29] 能生产出绿色畜产品，确保人类食物安全。 [30][31] 5.添加微生态制剂喂养动物，提高了动物对氮素的利用率，[32] 使畜禽圈舍内的氨（NH3）、硫化氢（H2S）、吲哚以及粪臭素等的含量大大降低，起到净化畜舍环境的目的，有益于环境保护。[33]
3 微生态制剂的应用及存在的问题
在微生态制剂中,活的微生物饲料添加剂对于家畜肠道微生态平衡有着突出的效果, [34] 通常情况下,益生菌可以定植动物肠道内,促进整个消化道及机体的健康。 [35] 此外，益生菌还可以作为日粮微生态佐剂，可以通过调节体液和系统免疫改善家畜的生理状态，[36][37] 并且可以促进肠道营养物质的吸收和肠道微生态平衡。[38] 包括乳酸菌在内的益生菌对多种肠道疾病有潜在的抑制作用，如腹泻、肠炎、结肠癌等。
益生菌添加剂对畜禽具有助长、促消化代谢、增强免疫力、保护生态环境等特点，尤其是能有效提高反刍动物饲料中粗蛋白、粗纤维的转化率。[39] 但是并不是任何条件下的添加剂都可以发挥作用，如加入的菌株在宿主体内不生长，或者添加剂中活菌数量较少，或者同一添加剂中的几种菌株具有拮抗作用，添加剂的作用效果都会下降甚至是无效的。[40] 因此为了保证添加剂的最大有效活力，不同添加剂应该对不同微生物具有针对性。这样可以使繁殖速率更快，缩短益生菌同肠道不同微生物重新组合的滞后时间，因此就需要考虑多种因素，如益生菌来源、微生物组成等，因此根据不同的动物筛选适宜的菌株就显得尤为重要。至于益生菌在应用领域是否存在一定的风险，会不会带来一些负面的影响，目前还处于试验阶段，除了少数问题，诸如感染和菌血症，免疫异常，细菌耐药以及使用剂量的选择外，[41] 还没有其它的问题，相比而言，使用抗生素所带来的负面效应要严重的多,而且在使用益生菌出现的病症中都是伴有基础病症，对于正常个体来说，尚未见有报道，只是对于益生菌的长期影响目前还不是很清楚，也缺乏足够的例证，但是对于短期效果还是很显著的。
4 结语
目前益生菌添加剂已在畜禽饲养业中广泛应用，而在野生动物饲养业的研究与应用，国内外均未系统开展。有研究证明益生菌制剂能够有效提高蓝狐的消化能力和免疫机能。[42] 但是对于益生菌制剂应用在其它毛皮动物上的研究较少。
我国毛皮动物饲养历史较短，但在科技研究方面已取得较多的丰硕成果。据统计，到2006年底我国三大主要毛皮动物貂、狐、貉的饲养总量已达6000万只，其中水貂2100万只，狐狸2600万只， 貉1300万只。毛皮动物的健康直接涉及到毛皮品质。腹泻是一种对貂狐貉危害严重的病症，发病率和死亡率极高。据统计，因腹泻死亡的水貂约占死亡总数的75-81%，并且由于微生态紊乱导致的消化道疾病较多见。[43] 在生产实践中，控制水貂狐狸腹泻性疾病，尚有一定的难度。因为病因比较复杂，确诊困难，易造成误诊；而且消化道内有益的微生物也在治疗过程中被抑制或杀灭，使正常微生物群的平衡受到破坏，因而久治不愈。此外，应激因素诸多，导致病情急剧加重，从而大大增加了该病的死亡率。针对这一现状，引入绿色、高效、无害、无污染并且具有生态安全，应用方便，价格低廉的同源益生菌既顺应了当前养殖业注重绿色、安全、环保的主流，在现实应用中具有非常重要的理论和实践意义。
到目前为止，我国关于微生物添加剂用于毛皮动物饲养业的研究报道极少。水貂的消化特点同其他单胃动物相比具有其独特性，即消化道短，胃容积小，肠容积小，肠道总长度仅为体长的4～5倍，无盲肠。在消化酶中蛋白酶和脂肪酶多，淀粉酶较少。食物通过消化道的速度快。研究健康水貂的其消化道中所附着的有益菌，对探讨毛皮动物消化道微生态环境，改善动物的健康状况，开发新饲料资源提供新材料具有重要理论和现实意义。
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