文献综述 犬瘟热病毒（CDV）的分子特征及其分离方法
摘 要：为获知研究CDV的紧迫性和重要性，对CDV的分子特性，犬瘟的危害性和现阶段CDV分离培养方法进行了简单的总结，可总结出原代细胞和传代细胞各有优缺点，构建稳定表达信号淋巴细胞激活因子（SLAM）的细胞系来分离培养病毒是病毒分离发展的趋势。
关键字 CDV SLAM 病毒分离
犬瘟热（Canine Distemper,CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的一种高度接触性传染病[1]，引起高发病率和死亡率，是犬易患的一种严重的病毒性疾病。Laidlaw和Duncan（1926年）利用完全隔离饲养的犬和易感性极高的雪貂，进行人工感染试验，才肯定了本病的病原为病毒。各国学者已经对犬瘟热病毒的分离培养、理化特性、流行病学以及免疫与防控作了大量的研究。本病分布于全世界。1980年，我国首次分离获得此病毒。在我国，随着近几年来军犬、警犬、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅度增加以及异地交流的增多，犬瘟热在犬中的发病率和致死率均有升高的趋势,而且临床症状也与以往的表现有所不同。同时，国宝大熊猫等珍稀野生动物及猕猴等灵长类动物的CDV感染，使CDV的致病地位日益突出，引起了动物学界和医学界的普遍关注。
1 犬瘟热病毒的分子特性
犬瘟热病毒（canine distemper virus CDV）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属(Morbillivirus)的负链RNA病毒。基因组RNA的分子量为6×106Da，呈线性排列，全长15690nt，由不同的基因组成，按3’-5’顺序依次为N-P-M-F-H-L，长度依次为：1683nt，1655nt，1422nt，2205nt，1947nt，6573nt。犬瘟热病毒粒子呈多形性，多数为球形，直径大多数在150～330nm之间，蔗糖中的浮力密度为1.180～1.218，峰值为1.195。病毒粒子中的主要蛋白质有核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N）、磷蛋白phosphor protein，P）、大蛋白（the largevirus-specified RNA directed RNA polymerase protein，L）、基质膜蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、附着或血凝素蛋白（attachment protein or hemagglutinin protein，H）。负链RNA被一个螺旋状的核衣壳包裹，核衣壳主要是由N蛋白组成，P蛋白和L蛋白也是核衣壳的成分，后两者具有聚合酶活性，P、N和L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关。核衣壳由囊膜包裹，其内部为M蛋白，M蛋白在病毒囊膜内侧与核衣壳的连接中起桥梁作用。囊膜表面分布有H和F两种糖蛋白组成的纤突，二者在病毒的吸附和侵入宿主细胞过程中起作用，H蛋白起细胞趋向作用，而F蛋白是融合过程中所必需的，二者缺一不可，具有中和作用的抗H蛋白抗体和抑制细胞融合的抗F蛋白抗体，在抗CDV感染的机制中发挥重要作用[1]。目前犬瘟热病毒（canine distemper virus CDV）研究中H和F基因及其蛋白是热点。
2 犬瘟热的临床症状及危害
2.1 临床症状
犬瘟热（canine distemper CD）是由该病毒引起的一种急性、高度接触传染性疾病[2]。该病的临床症状为发热，流鼻涕，肺炎，厌食，结膜炎，腹泻，淋巴球减少症和脑炎[3]。报道证实 ,野毒株A75/17-CDV 持续感染中枢神经系统能造成慢性髓鞘脱失病[4]。CD还表现为急性鼻卡他及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重胃肠炎和神经症状。患病动物在康复后还易留有麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。
2.2 危害
犬瘟热（canine distemper CD）可引起大批犬、狐、貉和貂等动物发病，犬瘟热是当前养犬业和毛皮动物养殖业危害最大的疫病，经常引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30-80%，雪貂高达100%，经济损失严重。近年来，包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目中所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，均有CD自然发病的报道，甚至人也有CDV感染的病例，并且CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害也越来越大。犬瘟热的主要危害是3到6个月龄幼仔，这可能与幼仔断奶后失去母源抗体有关。本病多发生于寒冷季节(10月到第二年的2月)，似有一定的周期性，每2-3年流行一次，但现在由于各个地方交流频繁这种周期性不明显，常年发生。给毛皮动物养殖业造成巨大的经济损失。犬瘟热的防治显得尤为重要，为能更好的预防犬瘟热的爆发，对CDV特性的研究十分的重要。
3 犬瘟热病毒的分离
病毒分离是病毒研究的第一步。CDV负链RNA病毒抵抗力不强，对热、干燥、紫外线和有机溶剂敏感，易为日光、酒精、乙醚、甲醛与煤酚皂等灭活。在炎热季节，CDV在犬群中不能长期存活，这可能是犬瘟热多流行于冬春寒冷季节的原因。病毒不易存活本是好事，但是给病毒的分离带来了不便。此外，病料采集的部位、时间、样品处理、发病动物的抗病毒抗体水平等因素对病毒分离成功与否也有一定的影响，但最主要的是分离病毒的细胞是否敏感和有效。因此，选择适合培养的细胞是关键。目前，分离犬瘟热病毒用的组织细胞主要分为原代细胞及传代细胞系两大类。
3.1 原代细胞分离CDV
分离犬瘟热病毒的原代细胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、肾细胞、胚胎细胞、外周血淋巴细胞、T淋巴细胞、犬脑细胞、犊牛的肾细胞和T淋巴细胞、牛胚胎肺细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)[5]。鸡胚的绒膜囊可以用于少量病毒的分离，但要求几周连续接新的鸡胚，才可以产生明显的CPE，造价比较高[6]。用雪貂腹腔巨噬细胞成功分离到了CDV[7]。最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺巨噬细胞进行培养。Vantsis用感染动物的肺巨噬细胞直接培养，可以频繁地分离出病毒[8]。没有母源抗体的易感的犬的肺巨噬细胞对该病毒最易感，可形成典型的细胞病变（CPE）。
3.2 传代细胞分离CDV
分离犬瘟热病毒的传代细胞系有犬肾细胞系（MDCK）、猫胚胎细胞系（FE）、猫肾细胞系（CRFK）、乳仓鼠胎肾细胞系（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）及其克隆株（Vero E6）、BGMK细胞系、绒猴B淋巴细胞系(B95a)、人子宫颈癌细胞系(Hela)、人喉头癌细胞系(HEP-2)、CV-1(Tc7 clone)细胞系、Bsc-1细胞系、兔肾细胞系(RK13)、BD细胞系等。近年来，用Vero细胞分离培养CDV很有希望，被认为是首选细胞[9]。已有用Vero和CRFK成功分离出犬瘟热病毒的报道[5]。
用原代细胞分离CDV的优点是能快速的分离并且很好的保持病毒特性，但是原代细胞传代次数较少，对病毒培养不利。传代细胞虽然克服了传代次数的限制，能较好的分离得到犬瘟热病毒，但是由于传代细胞本身缺少CDV的受体——信号淋巴细胞激活因子（SLAM）和硫酸乙酰肝素（HS）, CDV不能与之很好的结合，从而限制了用传代细胞对犬瘟热的分离与培养。在CDV的体外研究中，习惯上用MDCK细胞和Vero细胞[10]，但这些细胞并不表达CDV感染的主要受体——信号淋巴细胞激活因子（SLAM）[11]，因此分离得到的野毒在这些细胞内出现不明显的细胞病变（CPE）[12]。同时有报道称用Vero细胞培养的麻疹病毒使其病原性发生丢失，而用绒猴B淋巴细胞系(B95a)培养的始终保持其毒力[13]。B95a细胞是由绒猴B淋巴细胞，经EB 病毒转化表达绒猴的SLAM的一种细胞因转化了信号淋巴细胞激活因子基因的绒猴B淋巴细胞系(B95a)可以很好的分离培养CDV且能出现明显的CPE，为研究CDV开辟了好的方法， 但B95a细胞在培养过程中会分泌少量的EB 病毒的犬瘟热病毒用于一般研究，不能用于新疫苗的研制；同时对实验室的等级要求比较高，还对实验人员存在潜在的危险。
3.4 构建表达信号淋巴细胞激活因子的细胞系分离CDV
最近研究证实存在于多种动物（人、犬、牛）的细胞上的信号淋巴细胞激活因子（SLAM；CD150）为麻疹病毒属中麻疹病毒，犬瘟热病毒，牛瘟麻疹病毒及牛瘟病毒的受体[14]。麻疹病毒和犬瘟热病毒同属于麻疹病毒属，两者具有很近的亲缘关系。SLAM是在淋巴细胞和树突细胞表达的糖蛋白[15]，是麻疹病毒的受体。B95a上的SLAM可能是CDV的唯一受体[16]。这个受体分子能使由B95a细胞分离得麻疹病毒对其有抗性的细胞内系内[16]，并产生明显的CPE。CDV以SLAM作为感染的受体，很好的解释了病毒在细胞内组织定位及其感染的淋巴细胞嗜性和造成感染宿主的机体免疫抑制等病理现象，但却很难解释CDV在感染宿主体内肺脏、肝脏、胃肠道等非表达SLAM的组织细胞大量分布的现象。很可能在细胞上还存在一种CDV受体。Fujita等证实用抑制SLAM表达的293细胞（人胚上皮细胞）仍能感染CDV[17]，支持CDV识别不止一种受体。报道与CDV为同一属的牛瘟麻疹病毒用硫酸乙酰肝素（HS）做为受体[18]。研究犬瘟热病毒的H蛋白和F蛋白发现上面都有与肝素(HS的类似物)的结合位点[17]，而H蛋白和F蛋白是病毒侵染细胞所必需。但是HS与CDV得结合能力很弱，有的学者认为它可能促进SLAM或CD46与病毒的结合从而促进病毒的感染。HS在动物细胞膜中广泛存在这就很好的解释了CDV宿主的广泛性。
对SLAM的认识，为构建稳定表达SLAM传代细胞系更好分离和研究CDV奠定了基础。该细胞系既克服了原代细胞传代次数的限制又具有安全的优点。构建的细胞系能很好的分离病毒且产生比传代细胞明显的CPE，在该细胞系分离得到的病毒的毒力不会丧失[12,19]。
4 结语
原代细胞快速地从病料中分离得到CDV且能保持毒株的病原性，由于传代次数的限制并不适合用此方法研究病毒。现在，对于新病毒株常用的细胞系有Vero,B95a和Vero-DST,细胞系的选择跟据毒株的差异而有所不同。用B95a和Vero-DST分别分离毒株的H基因上有两个氨基酸差异[20]。但当一株病毒适应Vero细胞系后，很快的会导致致病性和侵染性的丧失[21]。现在的CDV的分离培养方法极大限制了对该病毒的病毒学、血清学和病理学的研究。构建稳定表达犬瘟热受体的细胞系后可以更加深入的了解病毒感染的分子机制，对病毒的防治具有重大的意义。
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