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硕士论文-猪肺炎支原体P46基因的克隆表达及间接ELISA抗体检测方法的初步建立，共63页，33179字
中文摘要
猪气喘病的病原体是猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，该病分布
广泛，发病率高，自身致死率不高，但由于 Mhp 能破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障，从而继
发其他致病菌的感染，导致死亡率提高。此病在世界范围内广泛存在，造成巨大的经济
损失。目前国内对本病尚未有较好的血清学检测方法，本试验利用表达纯化的 Mhp P46
蛋白，初步建立了检测 Mhp 抗体的间接 ELISA 检测方法。
1、参考 GenBank 登录的猪肺炎支原体（Mhp）P46 基因序列，利用 Primer 5.0 软
件设计合成引物，利用重叠延伸 PCR（SOE PCR）对 MhpP46 基因的三个位点进行定点
突变，将 Mhp P46 基因序列中三个编码 Trp 的密码子 TGA 突变为 TGG，突变后基因克
隆到 pMD18-T 载体，经 PCR 和酶切鉴定构建正确的阳性质粒测序，结果表明突变成功。
突 变 后 的 Mhp P46 基 因 克 隆 到 原 核 表 达 载 体 pET-32a(+) 中 ， 构 建 了 重 组 质 粒
pET-32a(+)/P46，鉴定成功后，经 IPTG 诱导，成功地在大肠杆菌 Rosetta (DE3)宿主菌
中高效表达分子量约为 63.5kDa 的融合蛋白，并优化了最佳的表达条件。Western blot
分析表明该融合蛋白具有反应原性。
2、以纯化后重组融合蛋白为抗原，初步建立了检测 Mhp 抗体的间接 ELISA 方法，
确定了 MhpP46 蛋白抗原的最适包被浓度为 0.8μg/mL，最适封闭液为 5%脱脂乳，检测
血清稀释度为 1:20，抗原和抗体的作用时间为 30min，HRP-兔抗猪 IgG 的最适工作浓
度为 1:2000，最佳显色时间为 15min，确定阴阳性的临界值为 0.249，包被的重组蛋白
不与猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪絮状支原体、猪蓝耳病病毒、副猪嗜血杆菌的阳性
血清发生交叉反应，表明建立的 ELISA 诊断方法具有良好的特异性，批内和批间重复
性较好。所建立的 ELISA 方法与 IDEXX ELISA 试剂盒的符合率达 89.1%。为我国进行
Mhp 抗体的检测和流行病学调查提供了一种快速简便的血清学方法。
关键词：Mhp ；P46 基因；突变；表达；间接 ELISA
目 录
摘要..... I
ABSTRACT............II
缩略语及符号....... III
前言.. 1
文 献 综 述........... 2
1.猪肺炎支原体简介 ........ 2
2.猪肺炎支原体的分子生物学特性 . 4
3.猪肺炎支原体主要免疫原蛋白 ..... 4
4.猪肺炎支原体检测技术 6
5.重叠延伸 PCR 技术 ........ 9
试验一 猪肺炎支原体 P46 基因的克隆与表达.... 12
1. 材料与方法. 12
2. 结果与分析. 28
3. 讨论............. 37
试验二 猪肺炎支原体抗体 ELISA 检测方法的初步建立 ..... 38
1. 材料和方法. 38
2. 结果与分析. 41
3. 讨论............. 47
全文总结............... 48
参考文献............... 49
致谢............... 53